結核分枝桿菌是一種胞內病原菌，能夠運用多種策略干預宿主細胞的正常功能，從而逃逸宿主免疫反應，進而實現其在宿主細胞中的長期存活。
病原菌與宿主間相互博弈的動態過程及分子機理為抗結核治療、藥物研發等提供了新思路和特異性靶點。巨噬細胞與結核分枝桿菌的相互作用是結核病發病的關鍵環節，抑制巨噬細胞凋亡是結核分枝桿菌逃逸宿主免疫的重要途經，因此研究結核與宿主巨噬細胞間的相互作用至關重要。
下面和大家分享一篇由劉翠華、戈寶學老師為通訊作者在Cellular & Molecular Immunology 上發表的綜述文章。
在這篇綜述中，全面、系統地總結了結核分枝桿菌先天免疫逃避機制，以促進其自身的細胞內生存。
該文回顧了：
1、結核菌調控宿主的細胞內核酸受體信號通路；
2、結核分枝桿菌如何繞過宿主細胞固有免疫策略，如膜轉運及膜完整性、細胞死亡和自噬；
3、結核菌操縱宿主先天免疫分子調節機制的策略，包括核內調節機制、泛素系統和細胞固有免疫成分。可以幫助我們更好地理解結核分枝桿菌和宿主先天免疫系統之間復雜的相互作用，為了解結核發病機制提供新的見解，并有助于疫苗開發和結核病治療。
一、胞質核酸感應途徑
1-1 宿主免疫識別結核菌的胞質核酸感應途徑
感染后，Mtb 被吞噬細胞內化為吞噬體，在宿主胞質內釋放細菌 DNA 和 RNA。胞質傳感器 cGAS、IFI204、AIM2 識別結核菌 DNA，而 NLRP3、NOD2、RIG-I、MDA5、PKR 識別RNA。活化的胞質 DNA/RNA 傳感器進一步誘導炎癥小體或 NF-κB 和 IRF3 介導的先天免疫通路的激活，以調節宿主抗結核菌反應。
二、宿主固有免疫策略
結核菌激活宿主細胞免疫途徑，導致一系列的抗菌作用，如細胞吞噬、凋亡等，然而這些作用可以被 Mtb 防御和調節，使得自身在細胞中長期生存。
Mtb 的調控策略：干預宿主細胞膜轉運及膜完整性、細胞死亡、自噬過程，如圖1-2所示：
1-2 Mtb感染期間宿主細胞的免疫反應
a、Mtb 調節細胞膜轉運及膜完整性：(1)結核菌促進Rab5+、Rab11+而抑制 Rab7+、Rab20+的核內體募集到吞噬小體。(2)抑制溶酶體融合，引起吞噬體損傷，使其逃逸到宿主細胞質。(3)結核菌誘導線粒體膜通透性轉變 (MPT)，抑制宿主細胞膜修復，調節 ejectosome 形成和外泌體運輸。
b、細胞死亡：在 Mtb 感染過程中，可能會誘導細胞死亡模式，其中凋亡和焦亡被認為可抑制細菌胞內生長，促進抗結核免疫反應，而壞死性凋亡和鐵死亡則有利于結核分枝桿菌的復制和傳播。此外，中性粒細胞胞外誘捕 (NET) 相關 NETosis 可能誘捕結核桿菌，并促進免疫細胞相互作用。
c、細胞自噬：xenophagy 和 LAP 途徑都有助于宿主自噬相關的免疫清除。xenophagy 途徑可通過結核菌和 Mtb 吞噬體的 E3 泛素連接酶（Parkin 和 smurf1）泛素化或通過 Mtb 表面蛋白 Rv1468c 的結合；LAP 途徑由 NOX2 和 RUBCN 介導，促進 LC3 在 Mtb 吞噬體上的募集。然而，Mtb 可以通過調節宿主miRNA或使用一系列的蛋白效應子 (如 ESX-1、SapM、EIS 和 CpsA) 來破壞 xenophagy 和 LAP 途徑。
三、結核菌調節宿主先天免疫機制
Mtb 通過宿主-病原體分子相互作用來操縱宿主細胞固有免疫應答的調控機制，如圖1-3所示：
1-3 Mtb效應分子靶標宿主細胞和固有免疫的分子調控機制
在感染后，Mtb 將多種效應蛋白傳遞到宿主細胞中，與宿主泛素系統的分子組分和其它固有細胞免疫蛋白直接相互作用，從而破壞宿主固有免疫。同時，一些 Mtb 效應蛋白被確定為核調節素，它們進入宿主細胞核，參與宿主先天免疫應答的表觀遺傳和轉錄調控。
1、Mtb靶向核內免疫調節機制：
（1）一些Mtb核調節素作為組蛋白修飾酶參與宿主免疫反應的表觀遺傳調控。目前，已確定的靶向和修飾宿主組蛋白的 Mtb效應因子有 EIS、Rv1988、Rv3423.1。
- 感染過程中，EIS 增加組蛋白 H3 的乙酰化水平以調節宿主自噬激活。
- Rv1988 定位于宿主染色質，作為一種功能性的甲基轉移酶，可對 H3R42 上的精氨酸殘基進行二甲基化，以抑制一系列參與活性氧 (ROS) 產生的宿主基因。
- Rv3423.1 表現出組蛋白乙酰轉移酶活性，并靶向宿主 H3K9 和 H3K14。
（2）其它 Mtb 核調節素
- Rv2966c 是一種5-甲基胞嘧啶特異性 DNA 甲基轉移酶，主要參與宿主基因組 DNA 的甲基化，主要是感染非 CpG 胞嘧啶。
- 一些 Mtb 蛋白效應物表現出雙重調控功能，不僅針對宿主的胞質成分，而且模仿參與宿主核內過程的真核轉錄因子。① 分泌蛋白 PPE2 通過 SH3 樣結構域直接與宿主 NADPH 氧化酶的胞質亞基 p67phox?相互作用；PPE2 還可以與 NOS2 啟動子結合，限制宿主 ROS 的產生。② PtpA 被送入宿主細胞質，抑制宿主炎癥免疫反應，也可以進入感染細胞的細胞核，與多種宿主基因（如 GADD45A）結合并調節其表達，從而影響細胞的增殖和遷移。
2、Mtb 靶點：宿主泛素系統
（1）Mtb泛素結合蛋白 Rv1468c 位于細菌表面，它直接招募宿主胞質泛素，觸發 xenophagy，限制宿主炎癥反應。
（2）Mtb PtpA 通過一個獨特的泛素互作基元樣區域與泛素直接相互作用，激活宿主 p-JNK、p-p38 和 p-VPS33B 去磷酸化，從而抑制先天免疫應答。
（3）PtpA 與宿主 E3 泛素連接酶（包含TRIM27的三部分基元）的RING結構域結合，以對抗TRIM27促進的炎癥免疫反應和細胞凋亡。
（4）Mtb 分泌蛋白 Rv0222，與宿主 E3 泛素連接酶 ANAPC2結合，介導 Rv0222 的 k11 連接泛素化，從而抑制宿主 NF-κB 激活。
（5）Mtb 分泌的毒力因子 LpqN 與 E3 泛素連接酶 CBL 相互作用，CBL 在細胞對感染的內在反應中發揮調節作用。
（6）Mtb 分泌的毒力因子 Rv3354 能夠與 CSN5 相互作用，導致 cullin-RING 不穩定。
越來越多的證據表明，泛素系統經常被入侵的病原體吸收，然后在宿主的免疫反應中起著改變調節的作用。
3、結核分枝桿菌以固有的細胞免疫成分為靶點：
（1）EIS 靶向并乙酰化絲裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-7（MKP-7）來阻止宿主 JNK 依賴的免疫應答。
（2）MPT53 可以直接氧化 TAK1 上的硫醇，以促進 TAK1 介導的宿主超炎癥免疫反應。
（3）分泌蛋白PPE2通過SH3樣結構域直接與宿主 NADPH 氧化酶的胞質亞基 p67phox?相互作用，抑制 ROS 的產生，有利于 Mtb 在巨噬細胞內的存活。
接下來和大家分享劉翠華教授團隊的一篇研究論文，是與北京師范大學邱小波教授團隊以及微生物研究所高福院士團隊最新合作發表在 EMBO reports 上的題為“Mycobacterium tuberculosis?protein kinase G acts as an unusual ubiquitinating enzyme to impair host immunity”一文。
該文揭示了 Mtb PknG 可與宿主泛素系統的另一種關鍵蛋白——泛素耦合酶（E2）UbcH7 發生特異性結合，并催化一種非經典的兩步泛素化級聯反應來靶向調控宿主泛素系統，進而抑制宿主的固有免疫應答。
研究發現 Mtb PknG 是具有非經典的泛素激活酶（E1）和泛素連接酶（E3）活性的效應蛋白（且揭示了 PknG 可通過兩步介導底物的泛素化修飾），并可利用其雙功能酶活性促進宿主細胞中的 TRAF2 和 TAK1 的泛素化及降解，最終抑制 NF-κB 固有免疫信號通路的活化，從而促進病原體在細胞內生存。
一、Mtb PknG與E2蛋白UbcH7互作
本研究通過酵母雙雜交方法、免疫沉淀、pull down 等實驗，證明 E2 蛋白 UbcH7 與 pknG 蛋白互作。
圖2-1 Mtb PknG通過Ubl結構域與E2蛋白UbcH7相互作用。
二、PknG具有非經典E1異肽酶活性
體外泛素偶聯實驗，發現 PknG 可以作為一種非經典的 E1，利用 ATP 作為能量來源，促進 Ub 在 UbcH7 上的結合。對PknG 催化的 UbcH7 偶聯的時間過程分析進一步發現，在30分鐘內，UbcH7 偶聯的水平隨著時間的推移而增加（圖2-2）。
圖2-2 體外泛素偶聯實驗
與傳統的 E1 不同，PknG 可以直接催化 Ub 偶聯到 UbcH7 上，繞過 PknG-Ub 鍵合步驟（圖2-3）。
圖2-3 Mtb PknG體外催化Ub與UbcH7結合
注：PknG K181M，無活性激酶突變。
Lys82 為 PknG 催化 Ub 結合至 UbcH7 的位點，其間無需形成硫酯鍵連接的 PknG-Ub 中間體，而經典的 E1 通常催化 Ub 以硫酯鍵的形式結合至 UbcH7 的 Cys86 位點，且其間需要形成硫酯鍵連接的 E1-Ub 中間體（圖2-4A）。
圖2-4 Mtb PknG是具有異肽酶活性的非經典E1酶活
PknG 具有 Ubl 結構域依賴的非經典 E1 活性，可以在 ATP 存在下直接催化 Ub 偶聯到 UbcH7 的 Lys82 上，從而取消 UbcH7 的典型 E2 活性。進一步實驗表明， PknG 具有依賴于 Ile87 殘基的異肽酶活性（催化 Ub 自 UbcH7-Ub 復合物上解離）（圖2-4B、C）。
三、Mtb PknG通過抑制NF-κB激活來抑制宿主先天免疫
Mtb PknG 是否調節宿主固有免疫信號通路，在 HEK293T 細胞中對 PknG 及其突變基因進行熒光素酶報告實驗，PknG 可顯著抑制 TNFa 誘導的 NF-κB 信號通路，E190A 突變消除了 PknG 介導的 NF-κB 激活的抑制（破壞 PknG 和 UbcH7 之間的相互作用），而其它 PknG 突變（K181M、PknG ?TPR），沒有引起這種影響（圖2-5 A)。
圖2-5 Mtb PknG以E190位點依賴的方式抑制NF-κB的激活
構建敲除菌株 Mtb ?pknG、回補菌株，通過 qPCR、ELISA 檢測結核感染巨噬細胞過程中細胞因子的表達是否受 Mtb PknG 或其突變體的調控。
PknG 的缺失促進了 TNF 和 IL-6 等炎癥因子的產生（圖2-5B、C），降低了巨噬細胞中的細菌存活率（圖2-5D），這表明 PknG 抑制了炎癥因子的產生，提高了細菌的細胞內生存。
E190A 突變基本消除了 PknG 介導的對巨噬細胞中細胞因子產生的抑制作用（特別是在感染后0-8 h），而 K181M 突變部分消除了 Mtb PknG 介導的對巨噬細胞中細菌存活的抑制作用（特別是在感染后8 h）。
PknG E190A 和 K181M 雙突變 Mtb 菌株 (DpknG:PknG K181M,E190A) 比 DpknG:PknG K181M 和 DpknG:PknG E190A 菌株表現出更高的細胞因子產量和更低的細菌負荷，特別是在感染后8-24 h（圖2-5 B-D)。
以上結果表明，Mtb PknG 能夠以依賴于其 Ubl 結構域的方式特異性抑制 NF-κB 激活。
四、Mtb PknG具有非經典E1和E3活性，促進TRAF2和TAK1的降解
在 HEK293T 細胞中對 PknG 進行熒光素酶報告實驗，結果表明，PknG 抑制了 TAK1 或 TAB1 介導的 NF-κB 激活(圖2-6 A)。轉染 HEK293T 細胞和感染巨噬細胞的免疫共沉淀分析進一步證明 PknG 與 TRAF2 和 TAK1 相互作用（圖2-6 B-C）。在 WT Mtb 或 Mtb ?pknG:PknG 株感染的 U937 細胞中，TRAF2 和 TAK1 的蛋白水平顯著降低，但在 Mtb ?pknG 或 Mtb ?pknG:pknG E190A 菌株種并沒有降低（圖2-6 D）。這種作用在蛋白酶體抑制劑 MG132 處理的細胞中被消除（圖2-6E），從而表明 pknG 介導的 TRAF2 和 TAK1 蛋白水平的下降是由蛋白酶體降解引起的。
圖2-6 Mtb PknG通過與UbcH7結合，靶向TRAF2和TAK1降解
綜上所述，PknG 可能通過與 UbcH7 相互作用促進 TRAF2 和 TAK1 的蛋白酶體降解。
研究 PknG 對 TRAF2 和 TAK1 的 E3 活性，通過體外泛素化實驗，在 PknG 或 PknG P57A 突變體存在時，TRAF2 和 TAK1 明顯泛素化，但在 PknG E190A 突變體存在時，沒有泛素化發生（圖2-7 A和B），從而表明 PknG 擁有 E3 活性促進 TRAF2 和 TAK1 的泛素化。可見 WT PknG 和 PknG K181M 突變體促進了感染巨噬細胞中 Ubch7 依賴的 TRAF2 和 TAK1 的多泛素化（圖2-7 C和D）。UbcH7 和 Ub 添加到純化的 TRAF2 或 TAK1 蛋白中，促進了在 WT PknG 存在下的 TRAF2 或 TAK1 的泛素化（圖2-7 E和F）。PknG 促進了 k48 連接的 TRAF2 和 TAK1 的多泛素化，而不是 k63 連接的泛素化（圖6G和H），進一步證實了 PknG 的活性依賴于與 UbcH7 的相互作用（圖2-7H）。
圖2-7 Mtb PknG依靠Ubch7結合促進TRAF2和TAK1的lys48連接多泛素化
綜上所述，表明 Mtb PknG 通過非經典的 E1 和 E3 活性促進 TRAF2 和 TAK1 泛素化，最終導致其泛素化降解并抑制 NF-κB 通路。
五、Mtb PknG在體內抑制分枝桿菌的免疫應答
構建感染 WT Mtb 和不同 PknG 突變體的 Mtb 菌株的小鼠結核模型，在感染后0、5、10、15 和20天采集肺、肝和脾進行分析。qPCR 脾細胞的分析表明,與 WT 感染小鼠的脾臟相比，感染 pknG E190A 顯著增加腫瘤壞死因子和 IL-6 的 mRNA 水平（圖2-8 A和B）。CFU 計數和 HE 染色評估肺和肝臟病理變化，與 WT Mtb 菌株相比，感染后10天，?pknG:pknG E190A 菌株在肺部的細菌負荷和肺部和肝臟的細胞浸潤均下降（圖2-8 C和D）。這些數據表明，UbcH7 結合依賴的 PknG 的 E1 和 E3 酶活性有助于抑制體內先天免疫應答。
圖2-8 Mtb PknG在體內抑制分枝桿菌的免疫應答
綜上，該文創新性研究成果刷新了對已有泛素化催化機制的認識，揭示了一種病原菌靶向宿主泛素系統的新策略，提供了基于病原-宿主界面的抗結核治療新靶點（即 Mtb PknG 的非經典 E1 和 E3 酶活相關的 Ubl 結構域，該結構域與非致病性分枝桿菌及宿主細胞間幾乎無同源性）。
圖2-9 MtbPknG催化非經典兩步泛素化級聯反應抑制宿主固有免疫模式圖
晶諾可提供的分枝桿菌-宿主細胞相互作用研究方面的相關實驗內容：
常用巨噬細胞
THP-1、Raw246.7等。
常用分枝桿菌
恥垢分枝桿菌、BCG、H37Ra、H37Rv功能基因敲除、過表達和回補突變體文庫。
研究內容
結核菌-宿主互作（結核菌某基因作用）、某基因與易感性研究、藥物作用等方面。
歡迎各位老師交流和咨詢
文章鏈接
[1] New insights into the evasion of host innate immunity by Mycobacterium tuberculosishttps://www.nature.com/articles/s41423-020-0502-z
[2] Mycobacterium tuberculosis protein kinase G acts as an unusual ubiquitinating enzyme to impair host immunityhttps://www.embopress.org/doi/epdf/10.15252/embr.202052175
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