非結(jié)核分枝桿菌（NTM）是指除MTB復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌總稱，是一種環(huán)境生長菌，在自然界廣泛存在。目前全世界已發(fā)現(xiàn)NTM 190余種，但只有少數(shù)是致病菌，屬于條件致病菌，主要侵犯肺部。近年來國內(nèi)NTM發(fā)病率不斷增加，以鳥復(fù)合分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌最為常見。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不斷有新的菌種被發(fā)現(xiàn)、親緣關(guān)系密切的菌種被鑒定出來，使得NTM菌種分類更加細(xì)化和完善。

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菌種鑒定的目的是對NTM病進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，包括對NTM臨床相關(guān)性的判定，同時(shí)由于不同菌種對藥物的敏感性不同，菌種鑒定對治療方案的制定也具有重要價(jià)值。臨床最常見的快速生長分枝桿菌包括膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌和龜分枝桿菌，感染通常選用大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等藥物治療。最常見的慢生長分枝桿菌包括鳥分枝桿菌復(fù)合群(MAC，主要包括鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌)、堪薩斯分枝桿菌及蟾蜍分枝桿菌等，治療通常選取大環(huán)內(nèi)酯類和利福霉素類藥物，有時(shí)候加用注射類抗結(jié)核藥物。

目前常用商業(yè)化菌種鑒定試劑盒對NTM進(jìn)行菌種鑒定，具有操作相對簡單、在醫(yī)療機(jī)構(gòu)可獨(dú)立完成且能夠滿足臨床基本需求的優(yōu)點(diǎn)，但由于納入菌種數(shù)量有限，無法完全覆蓋NTM高流行地區(qū)實(shí)際分離到的菌種類型，容易導(dǎo)致鑒定失敗或錯(cuò)誤。而全基因組測序技術(shù)可以彌補(bǔ)并很好地解決此方面問題，因其具有較高的靈敏度及強(qiáng)大的鑒別能力，尤其是在無法獲得可能感染病原體線索的情況下優(yōu)勢更為明顯，故臨床應(yīng)用越來越多。

晶諾生物針對NTM菌種鑒定已經(jīng)建立完善的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析平臺。NTM分析服務(wù)從基因組提取開始，針對分枝桿菌的基因組特征，建立了針對性、標(biāo)準(zhǔn)化的基因組提取和質(zhì)控評估平臺；基于Illumina測序平臺獲得高通量測序數(shù)據(jù)，對測序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得基因組草圖，通過與NTM參考基因組進(jìn)行Pairwise基因組核酸相似度（gANI）分析。數(shù)據(jù)分析中以95%的相似度為閾值進(jìn)行分枝桿菌物種判定，同時(shí)可根據(jù)相似度矩陣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析種間及種內(nèi)群體多樣性。

接著為您介紹一下晶諾生物NTM測序的質(zhì)控及分析平臺：

 

一、質(zhì)控平臺

為了從源頭上保證測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性，對樣品提取、DNA檢測、建庫、測序每一個(gè)生產(chǎn)步驟都嚴(yán)格把控，從源頭上確保了高質(zhì)量數(shù)據(jù)的產(chǎn)出。

1、DNA提取：

基因組提取我們采用改良版的CTAB法，由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員處理，以保證DNA的高質(zhì)量。

2、建庫前質(zhì)控：

使用Qubit熒光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 5400對DNA的純度、完整性及濃度進(jìn)行精確檢測，樣本合格后建庫。

3、文庫及測序數(shù)據(jù)質(zhì)控：
文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進(jìn)行檢測，插入片段大小符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，多個(gè)環(huán)節(jié)并重以保證文庫質(zhì)量。文庫檢測合格后，按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求將不同文庫pooling至flowcell，cBOT成簇后使用Illumina高通量測序平臺NovaSeq 6000進(jìn)行測序，原始數(shù)據(jù)量產(chǎn)出1G以上。

 

二、NTM分析內(nèi)容

1、非結(jié)核分枝桿菌物種鑒定（流程如下）

 

物種鑒定結(jié)果示例：

以95%的相似度為閾值進(jìn)行分枝桿菌物種判定，同時(shí)也可分析出相應(yīng)的亞種。

 

2、系統(tǒng)進(jìn)化樹

NTM樣本系統(tǒng)進(jìn)化樹示例：

根據(jù)相似度矩陣構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析種間及種內(nèi)群體多樣性。

NTM常規(guī)分析結(jié)果交付內(nèi)容：測序原始數(shù)據(jù)、拼接數(shù)據(jù)、NTM鑒定結(jié)果（excel)、系統(tǒng)進(jìn)化樹。

 

3、高級分析*

（1）分枝桿菌毒力基因分析：通過同源性比對分析分枝桿菌毒力相關(guān)基因在測序菌株中的情況，并進(jìn)行聚類分析。

（2）細(xì)胞壁重要脂質(zhì)成分合成基因簇分析：細(xì)胞壁脂質(zhì)是分枝桿菌致病性的重要因子，根據(jù)相關(guān)合成基因的分布情況，評估測序菌株細(xì)胞壁脂質(zhì)情況。

除以上分析，我們還可以提供對菌種鑒定后的突變信息分析，可分析出對比參考基因組的基因突變情況，導(dǎo)出基因突變信息（SNP、插入缺失小片段）。

*基礎(chǔ)分析不包含高級分析

 

歡迎感興趣的老師前來咨詢哦！

 

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